北京時間2022年12月16日，廣東省智能科學與技術研究院（以下簡稱廣東省智能院）王斌研究員實驗室（腦認知神經網絡發育和疾病研究組）與中國科學院分子細胞科學卓越創新中心鮑嵐研究員實驗室以及復旦大學生物醫學研究院楊力研究員實驗室合作在國際學術期刊 EMBO Reports以Resource形式在線發表了題為“ Somatosensory neurons express specific sets of lincRNAs, and lincRNA CLAP promotes itch sensation in mice”的研究論文。該研究通過單細胞測序系統性地分析并構建了初級感覺神經元中細胞類型特異性的長鏈基因間非編碼RNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）表達譜，同時揭示細胞類型特異表達lincRNA CLAP參與調控癢覺功能及其分子機制。
王斌研究員和鮑嵐研究員團隊長期對非編碼RNA在神經元發育中的功能及其分子機制進行研究。課題組前期的研究工作發現，初級感覺神經元軸突中富集的microRNAs（miRNAs）通過調控軸突中的mRNA局部翻譯參與軸突延伸（Wang et al., Cell Reports, 2015; Wang & Bao, Journal of Molecular Cell Biology, 2017）。課題組最近的研究發現，軸突富集的長鏈非編碼RNA（lncRNA）ALAE通過競爭RNA結合蛋白 KHSRP與Gap43 mRNA的相互作用進而調節軸突局部翻譯和軸突生長(Wei et al., Cell Reports, 2021)，lncRNA Dubr的m6A動態修飾通過穩定RNA結合蛋白YTHDF1/3介導mRNA翻譯從而參與神經元遷移和軸突發育（Huang et al., Cell Reports, 2022），這些研究進一步揭示了神經元特異分布的非編碼RNA在神經系統發育中發揮重要調控作用。
初級感覺神經元屬于假單極神經元，它的胞體聚集形成背根神經節（Dorsal root ganglion，DRG）。DRG神經元能夠把外周刺激通過脊髓進而傳至大腦，傳遞疼痛、冷熱、癢、機械和本體等多種感覺。在DRG神經元中存在高度特化的不同類型神經元，合作實驗室張旭研究員團隊前期的研究通過單細胞測序將DRG神經元分為10個大類和14個亞類，同時揭示不同類型神經元參與不同外周刺激的感覺傳遞（Li et a., Cell Research, 2016; Wang et al., Cell Research, 2021）。盡管對初級感覺神經元的分類和功能有所了解，但神經元類型特異的分子調控機制還遠未研究清楚。
lincRNA是一類轉錄自編碼基因間區域、缺乏蛋白翻譯能力且長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。目前多組學測序數據分析提示，在神經系統中的lincRNA比mRNA具有更高的組織特異性，并可能發揮重要作用。因此，探究lincRNA在不同類型DRG神經元中的分布、功能及作用機制對解析不同外周刺激引起感覺傳遞的分子機制有重要意義。
本研究首先通過整合分析Smart-seq2和10x Genomics的初級感覺神經元單細胞測序數據，構建了單個神經元lincRNA的表達譜。通過計算特異性指數（Specificity measure, SPM）方法篩選并發現了200個細胞類型特異且高表達的lincRNA，并進一步通過單細胞PCR、原位雜交和流式分選等方法對不同細胞類型lincRNA進行了驗證。同時，還發現細胞類型特異的lincRNA與其基因組上臨近基因存在高度相關性，由于細胞核中定位的lincRNA能夠參與調控臨近基因的表達，提示細胞類型特異的lincRNA可能具有順式調控作用。
單細胞測序鑒別初級感覺神經元細胞類型特異lincRNAs
隨后通過對細胞類型特異性lincRNA的進化保守性分析，發現在生長抑素（Sst+）表達的神經元中lncRNA 9130409J20Rik 特異性高表達，并且在多物種中保守性最高。利用基因共表達分析，提示lncRNA 9130409J20Rik與癢覺功能高度相關，因此我們將其命名為CLAP （Cell-type-specific LincRNA Associated with Pruritus）。進一步采用神經元鈣成像、小鼠鞘內注射siRNA和AAV病毒攜帶shRNA后的癢覺行為學檢測以及RNA-seq等實驗，發現敲低CLAP顯著抑制組胺對Sst+神經元的激活、降低小鼠對組胺誘導的癢覺抓撓反應以及導致Sst+神經元中與癢覺相關基因的顯著下調。最后，通過對高通量免疫共沉淀測序數據庫（CLIP-seq）分析、RNA免疫共沉淀和小鼠鞘內注射siRNA等實驗，發現RNA結合蛋白MSI2與CLAP相互結合并參與調控CLAP對癢覺相關基因的表達。
通過單細胞測序構建初級感覺神經元細胞類型特異lincRNA表達譜并發現
lincRNA CLAP調控癢覺的功能和分子機制
綜上所述，本研究通過單細胞測序建立了初級感覺神經元類型特異分布的lincRNA表達譜，揭示了細胞類型特異性表達的lincRNA在癢覺傳遞中發揮調控功能及其分子作用機制。該研究不僅有助于深入理解神經元不同類型特異分布的lincRNA在不同軀體感覺信息傳遞中的作用和機制，而且為疼痛和慢性瘙癢等感覺相關疾病的發生機制和臨床診療提供了理論基礎。
廣東省智能院王斌研究員、中科院分子細胞卓越中心鮑嵐研究組博士研究生姜博文和中科院上海營養與健康研究所楊力團隊博士研究生李國衛為本文共同第一作者。鮑嵐研究員、楊力研究員和王斌研究員為共同通訊作者。這項工作得到了中科院上海高等研究院/廣東省智能科學與技術研究院的張旭研究員、廣東省智能科學與技術研究院的李昌林研究員、復旦大學腦科學研究院的韓清見研究員和浙江大學醫學院的徐貞仲研究員的大力支持。該工作得到了國家基金委、廣東省高水平創新研究院項目和中國醫學科學院項目的資助。
文章鏈接：https://www.embopress.org/doi/abs/10.15252/embr.202154313
